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DNA 甲基化測序常用方法
發布時間： 2021-08-26 點擊次數： 2002次隨著高通量測序技術（NGS）技術的發展，使我們能夠從全基因組水平來分析 5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發現很多傳統的基因組學研究所不能發現的東西，這就是所謂的“DNA 甲基化測序"！
DNA 甲基化測序方法按原理可以分成三大類：
1、重亞硫酸鹽測序；
2、基于限制性內切酶的測序；
3、靶向富集甲基化位點測序；
基于以上原理又有數種不同的測序方法，下面，就介紹 10 種 DNA 甲基化測序的常用方法：
1) 重亞硫酸鹽測序
該方法可以從單個堿基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重煙硫酸鹽對基因組 DNA 進行處理，將未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶。而發生了甲基化的胞嘧啶未發生脫氨基，因而，可以基于此將經重亞硫酸鹽處理的和未處理的測序樣本進行比較來發現甲基化的位點。
2）重亞硫酸鹽處理后接頭標記技術(PBAT)
為了避免重亞硫酸鹽處理時模板的丟失，通常會在重亞硫酸鹽處理后進行接頭連接和隨機引物的擴增。
3）限制性內切酶-重亞硫酸鹽靶向測序(RRBS)
該技術是指對基因組上 CpG 島或 CpG 甲基化較密集的區域進行靶向測序。樣本首先經幾種限制酶進行消化處理，然后經重亞硫酸鹽處理，最后再測序。這種方法可以發現單個核苷酸水平的甲基化。
4）氧化-重亞硫酸鹽測序(oxBS-Seq)
5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)是 5’甲基胞嘧啶脫甲基成胞嘧啶過程的中間產物，重亞硫酸鹽測序無法對二者進行區分。通過氧化-重亞硫酸鹽測序，5’甲基胞嘧啶保留，而 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，進而脫氨基成尿嘧啶。通過將經過氧化處理和未處理的樣本進行測序比較，即可從單個堿基水平分辨 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)和 5’甲基胞嘧啶。
5）TET 輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)
TAB-seq 采用葡萄糖亞胺與 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)作用來保護免受 TET 蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，進而可以從單個堿基水平鑒定 5’羥甲基胞嘧 啶(5’hmC)。
6）甲基化敏感性的限制酶測序(MRE-Seq)
MRE-Seq 將甲基化作用的敏感性和限制酶的特異性結合起來進而鑒定 CpG 島的甲基化狀態。
7）HELP-Seq
HELP-Seq 采用 HpaII 及其甲基化不敏感的限制性內切酶 MSPI 處理，來對基因組內及基因組間的甲基化位點進行比較，進而實現甲基化測序。
8）甲基化 DNA 免疫共沉淀測序(MeDIP)
MeDIP 是一種采用抗體或甲基化 DNA 結合蛋白來捕獲富集甲基化 DNA 的技術，這種技術可以發現基因組中高度甲基化的區域，如 CpG 島，但不能進行單個堿基水平的分析。
9)甲基化結合域捕獲技術(MBD-CAP)
MBD-CAP 技術利用甲基化 DNA 能夠結合蛋白 MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI 來對甲基化的 DNA 進行免疫沉淀。與 MeDIP 技術相似，該技術也是可以發現基因組中高度甲基化的區域，不能從單個堿基水平分析甲基化。
10）基于探針的靶向富集技術
甲基化測序靶向富集技術采用合成寡核苷酸探針來捕獲 CpG 島、基因啟動子區域以及其他一些顯著性甲基化的區域。目前，市面上已有這種商品化的試劑盒。
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