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電泳中的異常現(xiàn)象及其原因分析
發(fā)布時(shí)間： 2021-08-26 點(diǎn)擊次數(shù)： 12955次跑電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)。只要做分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。有時(shí)候，跑電泳跑著跑著也會(huì)出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面，談一談跑電泳的過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生的異常現(xiàn)象，可能的原因，以及處理的方法。
1. 加樣孔有熒光
下圖的紅框部分就是一個(gè)典型的加樣孔有熒光的例子。發(fā)生這種現(xiàn)象可能的原因如下：
首先一定有 DNA 的滯留，其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會(huì)被 EB 染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組 DNA (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨(dú)就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時(shí)候，是比較大的 DNA 與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與 核酸幾乎都有比較強(qiáng)的結(jié)合能力(基因組 DNA 的 PCR 產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強(qiáng)度與體系的特異性成反比)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。
那么，這么多種可能性。到底是什么東西殘留呢？過(guò)往的經(jīng)驗(yàn)是：蛋白質(zhì)殘留的熒光有點(diǎn)發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。如上面那個(gè)例子，這么亮，這么銳利，肯定不會(huì)是蛋白質(zhì)啦。
2.總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮
如下圖所示，18S 明顯地比 28S 亮了。
如果 28S 和 18S 的條帶清晰無(wú)彌散，那么多提示 28S 沒(méi)有被 EB 飽和。RNA 殘留多時(shí)，基 因組 DNA 的電泳也會(huì)有相似現(xiàn)象。解決方法：簡(jiǎn)單的補(bǔ)染就可以解決此問(wèn)題。再次電泳時(shí)， 或者降低上樣量，或者直接增加膠中 EB 的量。保證 28S 比 18S 亮堂很多很多。
3. 降解
降解的現(xiàn)象，其實(shí)是千奇百怪的。可以簡(jiǎn)單總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時(shí)還伴隨下列的一個(gè)或者多個(gè)現(xiàn)象，則需要更進(jìn)一步的檢測(cè)：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個(gè)方向、從加樣孔即開(kāi)始發(fā)生彌散。 如下圖所示，紅框里面的就是典型的降解的現(xiàn)象。
其實(shí)，以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在*勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總 RNA 抽提為例，總 RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細(xì)胞、貼壁 細(xì)胞、組織。*裂解懸浮細(xì)胞的時(shí)間最短，*裂解組織的時(shí)間最長(zhǎng)，這就是降解多發(fā)生在*勻漿之前的一個(gè)佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴(yán)格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是，有許多實(shí)驗(yàn)室并不具備嚴(yán)格的保存手段，實(shí)驗(yàn)人員的操作也并非完好，其結(jié)果就是核酸的降解。
事實(shí)上，RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，無(wú)論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻*，可以預(yù)期的降解為：細(xì)胞：不應(yīng)該降解，碾碎的組織：不應(yīng)該降解，大塊組織：部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細(xì)胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細(xì)胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。即使蛋白酶 K 失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細(xì)胞的基因組 DNA 在抽提過(guò)程中間不被降解。
說(shuō)了這么多。那么，如何才能減少或者杜絕核酸降解呢？那就是：一定要將重點(diǎn)放在樣品被*勻漿之前。樣品的保存在前面寫(xiě)的 RNA 的提取一節(jié)里面已經(jīng)說(shuō)過(guò)了，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來(lái)的生存環(huán)境或者低溫到被*勻漿之間的時(shí)間。越快越好。
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