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細胞死亡的三種方式以及倆種凋亡細胞的檢測方法（Tunel、Annexin V）
發布時間： 2025-04-01 點擊次數： 1045次細胞死亡
動物細胞的死亡主要有三種方式：細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。目前對動物細胞凋亡的特征、機制和生物學功能的研究較為深入。
細胞凋亡也被稱為程序性細胞死亡 (programmed cell Death, PCD) 。PCD 最初是發育生物學中提出的概念, 其含義是發育過程中發生的某 類細胞的大量死亡,而這種細胞死亡要求特定的基因表達。細胞凋亡的典型特征是DNA規律性斷裂為 180-200bp整數倍的片段,并暴露出3'-OH 末端, 在瓊脂糖凝膠電泳時呈現有規律的梯狀條帶。
細胞壞死是區別于細胞凋亡的另一種典型死亡方式。當細胞受到意外損傷。如物理、化學因素或嚴重的病理性刺激的情況下細胞壞死才會發生。 此時細胞內 ATP 濃度下降, 細胞質出現空泡, 細胞質膜受損, 細胞內含物, 包括膨大和破碎的細胞器以及染色質片段釋放到胞外, 引起 周圍組織的炎癥反應。 與細胞凋亡不同, 細胞壞死過程中染色質不發生凝集 , 也不產生有規律的 180-200 bp 的 DNA 降解片段, 而是被隨機降 解, 瓊脂糖凝膠電泳時呈現彌散性分布, 俗稱 u 拖尾 n 現象。
細胞凋亡
凋亡過程模式圖
正常細胞 2.細胞凋亡的起始 3.凋亡中的細胞 4.凋亡小體被鄰近吞噬細胞吞噬
細胞凋亡檢測方式
細胞凋亡檢測有很多途徑和方式, Annex in v 法早期凋亡檢測, 線粒體膜通透性變化檢測, 凋亡蛋白酶活力檢測, TUNEL檢測, DNA ladder 電泳檢測等等。目前應用范圍最大的是能夠對早期凋亡進行檢測的Annexin V法，和能夠區分壞死和凋亡細胞并特異性標記出細胞凋亡的TUNEL法。
A Annex in V檢測
檢測原理：
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內側翻向外側。這一改變被認為是特異性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。Annexin V是一類廣泛分布于真核細胞胞漿內的鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白，分子量為35~36KDa，能與細胞凋亡過程中外翻到膜外的PS高親和力特異性結合，被作為檢測細胞凋亡早期的靈敏指標之一。
以經典方法 Annex in V-FIT C/PI 為例。 用標記了 FITC 的 Annex in V 作為熒光探針, 再結合核酸染料碘化丙啶 (prop idi um lodi de, PI ), 利 用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生, 并對凋亡細胞進行分群。 原理如下 :
FITC 標記的 Annex in V保留了與 PS 的高親和力, Annex in V-FIT C 染色可在凋亡早期就檢測到外翻的 PS, 識別出凋亡的發生。PI 是一種 核酸染料, pl 不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜, 但可穿透膜損傷的細胞, 如晚期凋亡細胞或者壞死細胞的細胞膜并與其內的DNA結合，將細胞核染色，可用來區分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞或壞死細胞。
方法優勢:
Annex in V 法檢測細胞凋亡主要有三大優勢:1）特異性標記早期凋亡細胞膜表面的PS，聯用核染料，對凋亡細胞進行分群和定量
2）精確反應細胞群體的凋亡趨勢
3）操作自由度高，發射波長不一致的情況下可兼容共染
數據展示
下圖使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A211)進行凋亡檢測。使用不同濃度的喜樹堿（Camptothecin,CPT）誘導健康Jurket細胞（人T淋巴瘤細胞）凋亡，并同時做競爭封閉實驗，證明Annexin V-FITC的染色特異性。
結果表明，Annexin V法可以對凋亡細胞進行分群（左下角細胞為未凋亡細胞，右上角為晚期凋亡細胞）并且可以對不同程度的凋亡進行區分
Annexin V-FITC/PI 染色檢測不同程度凋亡
用喜樹堿CPT誘導Jurkat細胞凋亡，誘導濃度分別為0、4、8、12、16uM，分別誘導4h后，參照產品說明書實驗方案進行染色，用流式細胞儀檢測結果如圖，（A）0 uM.（B）4 uM.（C）8 uM.(D)12 uM.(E)16 uM.(F)競爭封閉實驗，采用16uM CPT誘導Jurkat細胞4h后，參照說明書收集并洗滌細胞，于染色前加入無燃料標記的Annexin V蛋白孵育10min,再進行Annexin V-FITC/PI染色。無染料標記的Annexin V結合了細胞上的PS，再進行染色時，Annexin V-FITC無法結合PS，這說明了染色的特異性。
B TUNEL法
檢測原理：
TUNEL 測定法是一種末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法。這一方法借助一種可觀測的標記物，如熒光素，能對凋亡細胞的核DNA中產生的3’-OH末端進行原位標記。使用熒光顯微鏡即可進行觀察。TUNEL法中，直接標記步驟少，操作簡便，間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高，是目前檢測細胞凋亡最為常用、最為普遍的檢測方法之一。
TUNEL 根據標記物的不同，可以分為熒光法和顯色法兩種，熒光法需要使用熒光顯微鏡進行觀察，主要顯示的是細胞核的狀態，顯色法使用普通光學顯微鏡即可進行觀察，更方便對組織細胞本身的情況進行觀察。
方法優勢：
1）特異性標記凋亡細胞，而不標記壞死細胞；
2）相對于Annexin V從細胞群體角度反映凋亡，TUNEL法更有利于觀察組織、細胞的整體凋亡狀態；
3）TUNEL法使用樣本更廣：石蠟切片、冰凍切片、貼壁細胞、懸浮細胞；
4）方法兼容度高，可以根據自身需求進行免疫組化、免疫熒光共染等操作；
數據展示
Hela細胞爬片（共染GAPDH）
使用DNase I 室溫處理10min后進行TUNEL染色
使用產品：TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A113)
A:DAPI B:TUNEL染色，標記凋亡細胞 C：GAPDH D：Merge
小鼠肝臟石蠟切片
使用產品：TUNEL Colorimetric Apoptosis Assay Kit(Vazyme #A114)進行染色
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