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分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆
發(fā)布時間： 2025-03-18 點擊次數(shù)： 967次二、TOPO克隆
引物設(shè)計與PCR擴增
1. 目的片段 PCR 擴增引物合成時，要求引物 5’端不可磷酸化修飾；2. 建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。
PCR產(chǎn)物的純化回收
1.PCR 反應(yīng)后，產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；2.推薦使用切膠回收的方式純化 ( 切膠時間最好控制在 3min 內(nèi)，避免紫外照射對 DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應(yīng)當(dāng)≥ 30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；
3.回收濃度低時，可通過增加 PCR 反應(yīng)體系，采取多管反應(yīng)單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度。目的片段連接至載體
1.連接反應(yīng)體系按照說明書要求投入，各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；
2.連接反應(yīng)溫度可嘗試 25°C或 37°C，時間 5min，若不長克隆或克隆空載體 / 假陽性，時間可嘗試延長至 30min；
3.連接反應(yīng)建議在 PCR 儀中進(jìn)行。感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板
1.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞；
2.感受態(tài)細(xì)胞不可反復(fù)凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；
3.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞；
4.熱激時間：按照感受態(tài)細(xì)胞說明書操作進(jìn)行；
5.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；
6.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。
單克隆菌落PCR鑒定
1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；
2.挑取數(shù)個單克隆菌落進(jìn)行鑒定分析；
3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為PCR 反應(yīng)（10/20μl 體系）模板；
4.推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進(jìn)行 PCR 鑒定。
常見問題分析：
不長克隆
1. 片段類型錯誤：只兼容 PCR 擴增產(chǎn)物，且引物 5’端不可磷酸化修飾；
2. 片段投入不符合要求：片段應(yīng)當(dāng)切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系各組分投入體積不小于 1μl；片段投入量應(yīng)按照說明書公式計算；
3. 連接反應(yīng)不適當(dāng)：反應(yīng)應(yīng)在 PCR 儀中進(jìn)行，溫度可設(shè)置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min。
空載體 / 假陽性
1. PCR 擴增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；
2. 片段投入不符合要求：片段應(yīng)當(dāng)切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；片段投入量應(yīng)按照說明書公式計算；
3. 連接反應(yīng)不適當(dāng)：反應(yīng)應(yīng)在 PCR 儀中進(jìn)行，溫度可設(shè)置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min；
4. 菌液 PCR 用酶不適合：PCR 酶活應(yīng)當(dāng)不受雜質(zhì)影響，引物不應(yīng)選擇插入片段 PCR 用引物進(jìn)行檢測。
測序突變
1. 測序克隆數(shù)過少：測序單克隆數(shù)只有 1 個時，測序信息部分可信，建議多測幾個單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題，突變是否從模板引入；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實驗；位于其他部位的突變，應(yīng)當(dāng)使用高保真酶重新制備模板再次實驗。
測序片段不正確
1. PCR 擴增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；2. 模板存在 Amp/kana 抗性的質(zhì)粒：對目的片段進(jìn)行切膠回收。
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深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。可以在第一時間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時為客戶提供服務(wù)
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