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ATAC-Seq 實驗操作指南---02 ATAC-Seq 基本操作流程

發(fā)布時間： 2025-01-08　　點擊次數(shù)： 1997次

02 ATAC-seq 基本操作流程
本產(chǎn)品適用于哺乳動物細胞的染色質(zhì)可及性／開放性研究，針對的細胞投入量為100-100,000個。
必須具備的材料
1、ATAC-Seq建庫試劑盒
Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)
2、建庫接頭
單端96種接頭（每個貨號對應(yīng)24種接頭）：
TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)
雙端96種接頭：
TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)
雙端384接頭：
TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)
3、其他
Qubit 試劑（Vazyme #EQ121）、PCR儀、磁力架、低吸附EP管、PCR管、無水乙醇
注意事項：

6、擴增產(chǎn)物片段分選
推薦使用ATAC DNA Clean Beads對擴增產(chǎn)物進行兩步法片段分選，分選方案為0.55x／1.2x。
（1）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl（0.55x）至60μl PCR產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。
（2）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心轉(zhuǎn)移88μl上清（上清體積＝總體積93-5μl）至新的滅菌PCR管中，丟棄磁珠。
（3）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl（1.2x）至上清中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。
（4）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心移除上清。
（5）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30sec，小心移除上清。
（6）重復(fù)步驟5，總計漂洗兩次。
（7）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，開蓋空氣干燥約5min。
（8）將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脫。渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。
（9）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心吸取20μl上清至新的滅菌PCR管中，-30～-15℃條件下保存。

7、文庫質(zhì)控
1、用Qubit儀器和對應(yīng)的試劑測文庫濃度
2、安捷倫2100檢測文庫片段分布
測序技術(shù)參數(shù)推薦
1、測序策略：lllumina平臺，MGI平臺，PE 150
2、推薦數(shù)據(jù)量：開放染色質(zhì)區(qū)域的差異鑒定，不低于30M reads／樣本
ATAC-seq 技術(shù)關(guān)鍵
樣本準備
細胞活性
建議細胞活性＞90％，可以使用臺盼藍染色，進行細胞活力檢測；實驗過程中對細胞的操作應(yīng)盡量輕柔，以保持細胞的活性。生長狀態(tài)不佳或死亡的細胞中，蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的狀態(tài)會發(fā)生改變，甚至蛋白脫落，變成裸露的DNA，轉(zhuǎn)座子隨機切割可能產(chǎn)生較強的背景噪音，影響實驗結(jié)果。
細胞投入量與擴增循環(huán)數(shù)
受樣本類型的影響，實驗中可兼容的細胞投入量并不是固定的，早期實驗建議投入50,000-100,000個細胞。
文庫產(chǎn)出只要滿足上機需求即可，無需未來獲得更高的文庫產(chǎn)量而設(shè)置過高的擴增循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)過多會導(dǎo)致過度擴增、偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。
特殊樣本流程
特殊樣本流程摘要
特殊樣本的核提取以及操作流程可參考以下文獻

安培生物致力成為推動生命科學(xué)進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

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