成人午夜福利视频,另类小说区,gogogo免费高清在线完整版

技術(shù)文章ARTICLE

您當(dāng)前的位置：首頁(yè) > 技術(shù)文章 > CO-IP實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

CO-IP實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間： 2024-01-16　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1393次

原理：
CO-IP（免疫共沉淀）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。
從原理示意圖可見(jiàn)，免疫共沉淀利用抗原（紅三角）與蛋白 (藍(lán)圓柱) 的特異性結(jié)合，再通過(guò)連接著樹(shù)脂的抗體 (紫圓球) 去識(shí)別抗原，從細(xì)胞裂解液或者蛋白混合物中捕獲與抗原相作的蛋白。之后通過(guò)進(jìn)一步洗脫，獲取抗原-蛋白復(fù)合物，再對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
一、蛋白樣品制備
裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白樣品，以下為HEK293T細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：
1、收集細(xì)胞：10cm細(xì)胞培養(yǎng)板上，每板細(xì)胞加1ml ，4℃預(yù)冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反復(fù)沖洗把所有掛壁細(xì)胞洗下來(lái)轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管內(nèi) 離心：3400 rpm 2min。
2、清洗細(xì)胞：棄上清，（大槍頭套小槍頭）避免吸到沉淀。再加1mPBS，垂懸吹打；離心：rpm3400 2min。棄上清，將PBS吸凈后-80℃保存。
3、準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
4、裂解蛋白，收集的細(xì)胞中加入1000ul細(xì)胞裂解液10ul蛋白酶抑制劑，冰上靜置30min，每10min震蕩混勻一次，4℃，12000rpm離心10min，收集上清液。
5、每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃1 h以去除非特異性雜蛋白，降低背景。
6、4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中標(biāo)號(hào)Input，留Protein A珠子，標(biāo)號(hào)IP。
7、變性以及還原蛋白
室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合，IP組加入50ul蛋白上樣緩沖液，在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸，以充分變性蛋白。冰上驟冷，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可。
二、經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離樣品
膠的選擇與制備（根據(jù)目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）
1、凝膠的制備:根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 k Da選擇12%~15%的分離膠;大于20 k Da選擇10%的分離膠, 濃縮膠一般固定為5%。
2、上樣加入蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預(yù)染的marker。
3、加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恒壓電泳，約30min,當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用90V恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5cm處時(shí)關(guān)閉電源，取出膠板。
（注意：上樣時(shí)間盡量短，避免樣品擴(kuò)散，但也不能過(guò)快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）
三、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育
將蛋白凝膠中的蛋白，通過(guò)電流作用轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。
1、將剪好的PVDF膜用無(wú)水甲醇潤(rùn)濕30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開(kāi)始后續(xù)操作。
2、裝配轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)（在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產(chǎn)生）
黑面（負(fù)極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉(zhuǎn)印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然后將三明治轉(zhuǎn)移至電泳槽中，黑面對(duì)黑面。
3、加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中，300mA恒流轉(zhuǎn)膜60-90min。
4、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h。
5、選擇合適的一抗孵育，室溫?fù)u動(dòng)1h。
6、孵育二抗，4℃孵育2h或室溫（22-25℃）搖動(dòng)孵育1h。（抗體查相應(yīng)說(shuō)明書(shū)確定稀釋倍數(shù)）
四、顯影
1、配置稀釋液，將A液和B液按照（1：1）混合。
2、從TBST緩沖液中取出膜，去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥。
3、將有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張紙板上，加上配好的工作稀釋液。用量以覆蓋住膜為基準(zhǔn)。
4、將膜與工作稀釋液孵育1-5min,確保整個(gè)表面覆蓋。
5、去除多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中X膠片感光顯影定影。
注意：
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入 H2O2。
3、DAB 有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。
五、注意事項(xiàng)
1、上樣時(shí)，要迅速，避免樣品擴(kuò)散，也不能讓樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染。
2、全程操作中戴手套，不要用手觸膜。
3、如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2µm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。
4、某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。
5、如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。
6、曝光時(shí)。去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥，顯影液要現(xiàn)用現(xiàn)配。
7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脫液洗脫，重新孵育一抗二抗。
安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們?cè)谌珖?guó)主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)。

下一篇：細(xì)胞亞鐵離子熒光法測(cè)試盒-簡(jiǎn)介、特點(diǎn)

上一篇：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞如何傳代？

產(chǎn)品中心 Products

lishankj.com-美国式禁忌2,黑人刚破完处就三p,少妇被爽到高潮喷水,性猛交╳xxx乱大交

CO-IP實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)