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分子克隆實驗的注意事項和經驗分享
發布時間： 2024-01-16 點擊次數： 1512次簡介：
分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構建）技術是一種在分子水平上操作的技術，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉化和轉導等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進行復制與擴增。可以應用于蛋白表達、病毒包裝、基因治療、細胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細胞功能等研究。
具體操作流程：
一、聚合酶鏈式反應（PCR）
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點, 沿模板5'→3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。
（1）PCR反應基本成分：
①模板DNA
基因組DNA上的某個基因或DNA片段；也可以是mRNA反轉錄產生的cDNA鏈。 ②引物 先由引發酶（一種特殊的RNA聚合酶）在DNA模板上合成一段RNA鏈，它提供引發末端被稱為引物，接著由DNA聚合酶從RNA引物3^端開始合成新鏈。 ③dNTPs (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應中靶DNA序列擴增的原料。在PCR反應中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。 ④DNA聚合酶 該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識別和消除錯配的引物末端, 以校正復制過程中錯配的核苷酸。 通過雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation)，目的是要使雙鏈DNA解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ，作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應產物與引物相結合。適溫延伸 (extension)，引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據模板序列合成一條互補新鏈的過程。這三步反應反復循環。每一循環中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環中的模板。 （2）反應體系（50ul體系） 
（3）反應程序： 
二、線性化載體
在目標載體質粒上選取合適的位點進行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進行割膠純化。 環形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型： ①當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環形結構時,稱之為共價閉合環形DNA（cccDNA）,這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型； ②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環形結構,另一條鏈出現有一至數個缺口時,稱之為開環DNA（ocDNA）,此即OC構型； ③若質粒DNA經過適當的核酸內切限制酶切割之后,發生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA）,通稱L構型。 線性化之后的質粒比正常質粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。 三、純化PCR、酶切產物并連接
將反應結束的產物進行純化，純化所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；
連接線性化載體和PCR產物，可根據DNA連接酶試劑盒說明書設置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。
四、細菌轉化
冰上解凍克隆感受態細胞（DH5α）；取重組產物，加至感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。
五、菌落PCR 用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應程序可。 PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基，37℃搖起來。
注意事項：
聚合酶鏈式反應 ①所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。 ②PCR 試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水。 ③試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。 ④PCR 的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。 質粒轉化 ①冰上解凍感受態細胞：大腸桿菌經過低溫（0度)預處理的低滲cacl2溶液，造成細胞膨脹，細胞膜通透性發生改變，即易與外源DNA相黏附并在細胞表面形成復合物。 ②熱激轉化利用氯化鈣來產生富含鈣離子的環境，從而抵消質粒DNA和細菌細胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細菌胞膜表面形成小孔，質粒DNA就可進入細菌細胞。 菌落PCR ①在做菌落 PCR 的時候，每次都要做陰性、陽性對照，陽性對照可以用抽提好的質粒或基因組，這樣可以確定 PCR 主反應液的配制沒有問題。 ②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。
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