材料與儀器

反轉錄酶 末端脫氧核苷酸轉移酶 末端轉移酶緩沖液 熱穩定 DNA 聚合酶
擴增緩沖液 氯仿 dATP dNTP 貯存液 胎盤 RNase 抑制劑 TE 反轉錄酶緩沖液
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 制備型離心機 SorvallSS - 34 轉頭

步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

氯仿

dATP ( 1 mmol/L，二鈉鹽）

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L, pH 8.0)

胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/μl)

TE ( pH 7.6)

2. 酶與緩沖液

5X 反轉錄酶緩沖液

反轉錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶）

末端脫氧核苷酸轉移酶（末端轉移酶）

5X末端轉移酶緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCG3'）溶于水中（10 pmol/μl）

（接頭引物可以與基因特異性正向引物聯合在一起用于擴增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴增后，PCR 目的產物可能僅占總 DNA 產物的 1%，也可能多至占總 DNA 產物的 100%。如果必要，可用第一輪 PCR 產物作模板進行第二輪嵌套式 PCR，改善目的產物的產率，該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴增后，幾乎所有的擴增產物在 EB 染色下呈現了靶 mRNA 的 5' 區域序列相一致的條帶。

RT-PCR 的引物用自動 DNA 合成儀合成，用于標準 RT-PCR 的引物一般不需要進一步純化。然而，如果寡核苷酸引物經商品化的樹脂進行柱層析純化（如 NENLife- Science 公司產品 NENSORB) 或者經變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的引物用于擴增低豐度的 mRNA 時常常會更有效。）

（dT)17-接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)

基因特異性反義寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。

（基因特異性反義寡核苷酸引物應該與靶 mRNA 的已知序列互補，其長度在 20~ 30 bp，內含的 4 種堿基數量基本相等，G 與 C 堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發形成穩定二級結構的傾向。基因特異性引物 1 用于步驟 2, 用反轉錄酶引導基因特異性第一鏈 cDNA 的合成。基因特異性引物 2 是與靶 mRNA 的 5'序列互補的，用于 5'-RACE 反應的擴增階段。基因特異性引物 2 也總是被插入適當的限制性內切核酸酶酶切位點，這樣便于擴增 cDNA 的進一步克隆。）

隨機六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml，pH 8.0)

總 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)+ RNA（10 μg/ml）溶于水中

（總 RNA一般用離液劑（chaotropic agents) 從細胞中抽提的，選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過 RT-PCR 克隆靶基因。對于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進行 RT-PCR。運用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養細胞中制備。）

5. 離心機與轉頭

制備型離心機

SorvallSS - 34 轉頭

6. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

濃縮器（Centricon-100，Amicon 產品）

微量離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 儀

旋轉真空冷凍干燥機（可選擇）

水浴箱預設在 75℃ 和 80℃

二、方法

反轉錄

在實驗開始時，首先要確定 5'-RACE 是否成功。如果反轉錄步驟是有效的，那么分離到含有靶 mRNA 的 5' 末端序列的克隆的幾率是較高的。另一方面，如果反轉錄步驟是無效的，那么本方案的后續步驟是無法補償的。因此，對于反轉錄反應條件是值得花時間優化的，如最佳的引物與模板比例，改變反應體系 Mg2+ 濃度，尋找最適的 Mg2+ 濃度。

1. 轉移 1 pg 至 100 ng 的 poly (A) + RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調整體積至將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min, 將離心管插入冰中冷卻。

2. 向這種含有已變性的 RNA 樣品的離心管內依次加入如下試劑：

5X 反轉錄酶緩沖液                                 4 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

10 μmol/L 基因特異性反義引物 1             4 μl

約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑             1 μl

水補足至                                                20 μl

反應管溫育在反應 60 min。設置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應所需的所有試劑，但不加模板 RNA；第二支對照管加入除了反轉錄酶外的所有試劑；第三支對照管中加入除引物外的所有試劑。這些對照管進行所有的后續步驟。設置這些對照管能保證 cDNA 產物不是由于基因組 DNA 與寡核苷酸片段的污染或者由 RNA 模板分子的自身引導所致。

反轉錄產物的純化

反轉錄反應完成后，多余的 dNTP 和引物必須從反應液中去除。此外，dNTP 在反應液中的存在，一方面可能由末端轉移酶在  cDNA 的 3' 末端加尾，另一方面還可能危及第一鏈 cDNA 尾部序列作為引物結合位點的能力。多余的引物的存在也會造成不利的影響，因為引物的 3' 末端會與 cDNA 的加尾反應相競爭。

3. 去除過剩的寡核苷酸或隨機六核苷酸引物可用水將反應液終體積稀釋至 2 ml, 然后用 Centicon-100 微量濃縮器（Frohman 1993; for a description of this procedure， please see protocol 3 )。離心轉速為 500~1100 g ( 2000~3000 r/min, 用 Sorvall SS34 轉頭）， 溫度在 4℃ 和 25℃ 之間離心 20 min。重復用水稀釋步驟和離心步驟。轉移潴留的液體到一支新的 0.5 ml 離心管，用旋轉真空抽干機使體積濃縮至 10 μl。

4. 加入 10 體積的如下試劑至反轉錄 cDNA 樣品中：

5X 末端轉移酶緩沖液    4 μl

1 mmol/L dATP            4 μl

末端轉移酶                  10~25 單位

反應管孵育在 37℃ 水浴中反應 15 min。

5. 在 80℃ 放置 3 min 使末端轉移酶滅活。使帶有 dA 尾的 cDNA 樣品用 TE pH 7.6 稀釋至終體積 1 ml。

擴增

6. 按以下次序，將各成分加入在一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板的孔內，建立 PCR 系列反應管：

已稀釋 cDNA                                       0~20 μl

10X 擴增緩沖液                                    5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                 5 μl

10 μmol/L (dT)17-接頭引物（16 pmol）   1.6 μl

10 μmol/L 接頭引物（32 pmol）             3.2 μl

10 μmol/L 基因特異性引物 2 ( 32 pmol )  3.2 μl

1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶                  1 μl 

H2O 補足至                                          50 μl

如果實驗必要，可建立系列的擴增試驗管用于篩選 cDNA 加尾模板產生最大量的擴增 5' 末端。

7. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液上層加一滴石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。

8. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：

9. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

10. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 7)，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

11. 從擴增的 DNA 產物中分離掉殘余的熱穩定 DNA 聚合酶和 dNTP。

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