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真核細胞轉(zhuǎn)染操作步驟
發(fā)布時間： 2021-11-29 點擊次數(shù)： 1878次一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結(jié)果使得蛋白活性低或無活性。不僅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進行的裂解等等，而這些加工原核細胞則無能為力。需要表達具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于細胞膜表面的受體或細胞外的激素和酶，則更需要使用真核轉(zhuǎn)染技術(shù)。由于DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞有關(guān)技術(shù)方法的發(fā)展，使真核表達成為可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳動物細胞中表達蛋白質(zhì)，具有以下多種不同用途：
(1) 通過對所編碼的蛋白質(zhì)進行免疫學(xué)檢測或生物活性測定，確證所克隆的基因。
(2) 對所編碼的蛋白質(zhì)須進行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進行表達。
(3) 大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各種不同類型細胞中表達的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的情況。
(5) 通過分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性，闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
(6) 使帶有內(nèi)含子而不能在原核生物如酵母中正確轉(zhuǎn)錄為 mRNA的基因組序列得到表達。
(7) 揭示某些與基因表達調(diào)控有關(guān)的DNA序列元件。
DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)現(xiàn)已變成研究基因功能和組分的重要工具，已發(fā)展了很多轉(zhuǎn)染方法，并成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)染各種細胞。目前廣泛應(yīng)用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體，以及陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。
進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：
克隆目的基因(經(jīng)測序驗證)-準(zhǔn)備真核表達載體-將目的基因插入表達載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定
下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實驗操作。
一、試劑準(zhǔn)備
1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調(diào)pH到7.4,補ddH2O至100ml, pH7.4，濾過除菌。
2、核酸貯存液，過濾除菌。
3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細胞的正常培養(yǎng)。
二、操作步驟
(一)克隆目的基因
1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計擴增引物，并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特異性擴增片段，連入T載體。
3、轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒制備。
4、酶切初步鑒定，測序證實。
(二) 真核重組表達載體的構(gòu)建：
pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源DNA序列所必需的所有真核表達組件。
重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切
回收插入片段和pcDNA3線性片段
T4連接酶連接
轉(zhuǎn)化DH5α
質(zhì)粒制備
BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。
(三)重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細胞：
1、 G418篩選濃度測定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對照3復(fù)孔。以10-14天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為200mg/L。
2、 在轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞應(yīng)達到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿(35mm)，每孔1-2ml培養(yǎng)基3×105細胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細胞數(shù)量。
典型貼壁細胞平板密度
培養(yǎng)板大小 生長面積（cm2） 大約細胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ml） 組織培養(yǎng)皿（φ60mm） 28
6．6×105 5-6 6孔培養(yǎng)板（φ35mm） 9.5
3×105 1-2 12孔培養(yǎng)板φ22.6mm） 4
1．3×105 0．5-1 24孔培養(yǎng)板（φ8mm） 0．5
0．6×105 0．25-0．5 3、 SHG-44細胞的轉(zhuǎn)染：
(1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時間內(nèi)，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。
(2) 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。
(3) 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。
(4) 37℃孵育6hr。
(5) 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長培養(yǎng)基。
(6) 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴大培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對照組細胞即SHG-44。
(一)篩選結(jié)果鑒定：
(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因
(2)SHG-44-重組pcDNA3陽性細胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(Western-blot)。
(3)測定外源性基因?qū)HG-44細胞增殖的影響
①流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。
②細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍染色計數(shù)細胞→計算細胞生長抑制百分率。
③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細胞→0.3%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計數(shù)不可少于50個細胞的克隆數(shù)→計算克隆形成率抑制率。
三、注意事項
1、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間)每種細胞和質(zhì)粒均須進行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。
2、預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。
3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)溫。
脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。
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