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成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層實(shí)驗(yàn)步驟
發(fā)布時間： 2021-11-05 點(diǎn)擊次數(shù)： 2405次材料與儀器鏈酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 受精后8h的胚胎 FBS
LDF基礎(chǔ)培養(yǎng)液 LDF原代培養(yǎng)液 LDF維持培養(yǎng)液 D培養(yǎng)液 Holtfreter緩沖液
培養(yǎng)瓶實(shí)驗(yàn)步驟鱒魚胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系，在 10°C 條件下飼養(yǎng)，或者受精后 3 天的斑馬魚，在 28°C 條件下飼養(yǎng)），在 -80°C 條件下凍存
(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min
(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )
(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入 1 只新離心管，按操作步驟（c ) 離心
(f)收集上清液，留下剩余的脂質(zhì)，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g，60 min )
(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液，然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾
(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后，在 -80°C 條件下凍存
(j)為了用提取物培養(yǎng)細(xì)胞，測量蛋白質(zhì)濃度（見方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏，最長 2 個月
BRL 細(xì)胞條件培養(yǎng)液：
(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細(xì)胞（ATCC )
(b)當(dāng)細(xì)胞匯合時，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液，在 37°C 條件下培養(yǎng)
(c)5 天后吸出 LDF，過濾，在 -20°C 凍存
(d)向細(xì)胞中加入新鮮的 LDF，5 天后重復(fù)此過程。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后，將細(xì)胞分開培養(yǎng)，使細(xì)胞再次匯合
1. 收集約 30 個受精后 8 h 的胚胎。
2. 通過鏈酶蛋白酶處理，除去絨毛膜 [ Sun et al.，1995a ]。
3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min，同時用吸管輕輕吹打，以便使細(xì)胞分散。
4. 加入 FBS (終濃度為 10 % ) ，終止胰蛋白酶的消化。
5. 離心（500 g ，10 min ) ，收集細(xì)胞。
6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞移入 25 cm2 培養(yǎng)瓶。
7. 在 26°C 條件下，讓細(xì)胞貼壁和匯合。
8. 當(dāng)細(xì)胞匯合時，用同樣的培養(yǎng)液傳代。
9. 培養(yǎng) 2~3 代后，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞將混合出現(xiàn)。這些細(xì)胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基礎(chǔ)培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。通過不同的胰蛋白酶消化，為下一步培養(yǎng)篩選成纖維細(xì)胞。
(a)用胰蛋白酶處理細(xì)胞 1 min 以除去大部分成纖維細(xì)胞，保留貼在瓶壁上的上皮細(xì)胞。
(b)將成纖維細(xì)胞移入另 1 個培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞匯合時，重復(fù)以上過程。
(c)培養(yǎng) 2~3 代后，細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞。
10. 制備生長抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層：
(a)將細(xì)胞加入合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，使成纖維細(xì)胞生長成為匯合的單層。
(b)將 10 μg/ml 絲烈霉素 C 加入成纖維細(xì)胞中，在 26°C 條件下處理 3 h。
(c)用 LDF 浸洗 3 次后，可將生長抑制的成纖維細(xì)胞用作斑馬魚胚細(xì)胞培養(yǎng)的伺養(yǎng)層。
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