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病原微生物提取的方法有哪些？

發(fā)布時間： 2021-10-25　　點擊次數(shù)： 2545次

數(shù)據(jù)統(tǒng)計
據(jù) WHO 統(tǒng)計，全球感染性疾病導致的患者死亡占全部死因的 25%以上，在中國，感染性疾病占所有疾病的 50%以上，75%造血系統(tǒng)腫瘤患者和 50%實體腫瘤患者死于感染，膿毒癥（嚴重感染）患者病死率高達 50%。而在面對疑難重癥時，快速檢測病原微生物變得刻不容緩。

什么是病原微生物
病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來自患者樣本的病原微生物的基因物質（DNA和RNA），實現(xiàn)病原種屬的快速鑒定和深入分析。mNGS檢測技術由于通量高、快速、成本適宜、準確度高等特點，在感染性疾病領域應用愈發(fā)火熱，同時也正在改變原有的檢測手段，大大提高了危急重癥和疑難感染的診斷水平。

為什么要去除宿主DNA
mNGS檢測流程包括：臨床評估、樣本收集、保存和運輸、核酸提取、文庫構建、上機測序、數(shù)據(jù)分析和出具報告幾大步驟。多數(shù)臨床標本存在大量宿主細胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低，有些樣本中人源宿主DNA占比高達50-90%左右，這會導致后續(xù)測序數(shù)據(jù)中大部分是宿主DNA的信息，而病原微生物的數(shù)據(jù)占比較少，且宿主DNA 的非特異性序列還會干擾下游病原微生物的的判斷。針對這一問題，通常在核酸提取環(huán)節(jié)時去除宿主DNA或者增加測數(shù)據(jù)量的方式來提高病原微生物的檢出。接下來小編跟大家介紹幾個去除宿主DNA的小妙招~

怎么去除宿主DNA
目前去除宿主DNA的方法主要分為提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化學法，而提取DNA后去除主要通過抗甲基化DNA磁珠來實現(xiàn)。

1.物理法

該方法基于宿主細胞和微生物細胞大小的差異去除宿主細胞，例如粘膜上皮細胞平均大小為50 μm，而一些典型的細菌細胞一般是1 μm。這種情況下可以采用過濾法去除宿主細胞，或者根據(jù)細胞沉降系數(shù)的差別，利用離心法去除宿主細胞。但是該種方法無法有效去除胞外DNA。

2.生物法

基于微生物和動物細胞結構的不同，選擇性的裂解宿主細胞，利用核酸酶酶解掉釋放出來的宿主DNA，后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后純化微生物DNA。或者也可以利用人源細胞的細胞膜較微生物外壁脆弱的特點，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂苷）裂解宿主細胞釋放 DNA，再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ，后續(xù)進行微生物DNA提取等操作。該種方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]。

3.化學法

PMA（疊氮碘化丙錠）是一種可以高效結合dsDNA的染料，二者結合后熒光會增強，在可見光的誘導下，PMA分子的疊氮化物基團被光解并發(fā)生C-H插入反應并與DNA形成共價鍵，從而產(chǎn)生恒久性的DNA修飾，從而使DNA的片段化。由于這種染料無法通過功能完整的細胞膜，所以其可以標記裸露在外的DNA。該種方法先利用低滲溶液破壞人源宿主細胞，后利用PMA去除宿主DNA，后結合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后提取微生物DNA^[2]。

4.抗甲基化DNA磁珠

在原核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在腺嘌呤堿基（A）上，在真核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶堿基（C）上，人類基因中有90%以上的CpG位點被甲基化修飾。該方法先提取全部的DNA，利用帶有蛋白A修飾的磁珠，通過MBD2-Fc蛋白媒介，與宿主DNA中甲基化的CpG位點特異結合，可有效去除高達98%的甲基化宿主DNA，從而針對性的去除真核生物中常見的甲基化的核苷酸序列，可實現(xiàn)3~5倍富集^[3]。
如果某些微生物甲基化模式和宿主類似，在去除宿主DNA時也會被去除。

【參考文獻】
[1] Charalampous T, Kay GL, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 783‐792. DOI:10.1038/s41587‐019‐0156‐5.
[2] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [J]. Microbiome, 2018, 6(1): 42. DOI: 10.1186/ s40168‐018‐0426‐3.
[3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J]. Genome Res, 2019, 29(5): 831‐842.DOI:10.1101/gr.238170.118.

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