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【RNAi與siRNA技術(shù)】基因敲除鼠的實(shí)驗(yàn)建議
發(fā)布時(shí)間： 2021-08-27 點(diǎn)擊次數(shù)： 3083次如果是在做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且是基因敲除鼠的實(shí)驗(yàn)，那么就會(huì)做大批量的小鼠基因型鑒定試驗(yàn)，來(lái)確定自己小鼠的基因型，然而，再做實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)一些意想不到的結(jié)果，在這里為大家提一點(diǎn)點(diǎn)小建議。
提取 DNA
1、組織提取 DNA 剪下老鼠 0.5-1.2cm 尾巴或者耳朵或者稱取 20mg 組織樣本，將樣本剪碎放在 1.5ml 的 EP 管中。
2、在每個(gè) EP 管中加入 275 微升的裂解液（我們實(shí)驗(yàn)室使用的是 promega 的試劑盒）將加入裂解液的組織放在 55 攝氏度的水浴箱中過(guò)夜（16—18h）裂解*的標(biāo)志是組織*溶解。
3、第二天振蕩每一個(gè) EP 管，混勻后再離心，轉(zhuǎn)速 13000rmp 時(shí)間是 3 分鐘，取上清分離毛發(fā)，將取的上清加到柱型管中（有濾網(wǎng)的小柱型管，柱型管套裝在 1.5 的 EP 管中）。
4、在每個(gè)柱型管中加入 250 微升的 Wizard SV lysis Buffer，此裂解液需要提前水浴 30min， 55 攝氏度。
5、離心 3min 轉(zhuǎn)速 13000rpm ，倒掉濾液。
6、在每個(gè)管中加入 650 微升 wash solution 離心 1min 轉(zhuǎn)速 13000rpm，這一步驟重復(fù)四遍，每一次都棄去管底的廢液。 7、4 次洗完之后，什么都不加再離心一次，1min 轉(zhuǎn)速 13000rmp。
8、離心之后取出，放入到新的 EP 管中，每一個(gè) EP 管中加入 50 微升 Nuclease-free-water（無(wú)核酸酶水）需要提前水浴 30min 中 55 攝氏度。加的過(guò)程中要充分覆蓋管底，靜置 2min，離心 2min，保留 EP 管中的液體，此步驟重復(fù)兩次。（如果要擱置需要保存在-20 冰箱中）。
自此 DNA 已經(jīng)提取完成。
顯影
1、將獲得的液體加入 PCR 混合液中，凝膠電泳，鑒定基因型。 PCR 混合液的配制方法 ddH2O 9.5 微升，Taq12.5 微升，上游引物 0.5 微升，下游引物 0.5 微升。每一個(gè) EP 管中的總量是 24 微升，提取的 DNA 只加 1 微升。
2、PCR 擴(kuò)增：將樣品放入 PCR 儀擴(kuò)增。
3、制膠——1%的膠。
小膠：瓊脂糖 0.25g+25mlTEB1%
中膠：瓊脂糖 0.5g+50mlTEB1%
大膠：瓊脂糖 1g+100mlTEB1%
4、將瓊脂糖加入 TEB 溶液后微波爐加熱 3min，冷卻后加入核酸染料 EBC，倒入制膠器制膠，30min 后取出膠放入電泳槽中，黑線朝向正極。
5、加樣，加 Maker。
6、電泳。
7、顯影。
一些經(jīng)驗(yàn)
1、提取 DNA 的第一步中建議用小鼠的尾巴，優(yōu)選小鼠尾巴，減輕動(dòng)物疼痛且便于操作，在標(biāo)記過(guò)程中每一個(gè) EP 管要標(biāo)號(hào)無(wú)論蓋子頂部還是管壁，都要做標(biāo)記，因?yàn)橐谒∠渲羞M(jìn)行裂解。
2、在配裂解液的過(guò)程中，一般要多配出 2 份的量，因?yàn)樵诩訕拥倪^(guò)程中會(huì)有液體遺失，以防萬(wàn)一試劑缺如多配制 2 份。
3、在制備 pcr 混合液的時(shí)候無(wú)論是上游還是下游引物總量都不能過(guò)多，否則顯影的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，出現(xiàn)重影。
4、加入核酸染料的量是 3 到 5 微升。
5、加入的 maker 和樣品的量建議是 5 微升。
6、電泳的電壓建議 100v，時(shí)間是 45min。
7、使用離心機(jī)的時(shí)候要注意用常溫的離心機(jī)，非 4 度，因?yàn)闊o(wú)論是裂解液還是無(wú)核酸酶水都是經(jīng)過(guò)水浴箱 55 度溫浴過(guò)的，所以，用常溫的離心機(jī)即可。
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